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C-N鍵廣泛存在于活性天然產(chǎn)物、藥物分子之中，構(gòu)建C-N鍵也成了廣大化學工作者研究的重點方向。在諸多構(gòu)建C-N鍵的方法中，對有機分子中最廣泛存在的C-H鍵進行胺化，無疑是最為直接、高效的方法之一。然而已有的C-H鍵胺化策略嚴重依賴于昂貴的過渡金屬，成本高且環(huán)境不友好，開發(fā)更為綠色的反應體系則顯得十分重要。美國加州理工學院的化學家Frances Arnold教授在此領域已經(jīng)取得了一系列進展，她們開發(fā)了酶催化的分子內(nèi)C-H鍵胺化反應（J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 15505-15508；Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 125, 9479-9482）。相比之下，分子間不對稱的C-H鍵胺化較分子內(nèi)的反應難度更大，雖然已有一些銠、釕、錳金屬催化體系報道，然而迄今為止尚無廉價易得的催化劑能有效實現(xiàn)這一過程。而且，科學家也沒有發(fā)現(xiàn)有任何一種自然界中的酶可以催化這一反應。

近日，F(xiàn)rances Arnold教授再做突破，她領導的研究團隊通過定向進化方法發(fā)現(xiàn)了一種基于細胞色素P450單加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase）的工程酶，這種包含鐵-血紅素輔基的工程酶可以高效催化分子間芐位不對稱C-H鍵胺化反應。該工作發(fā)表在近期的Nature Chemistry 上，Christopher Prier 和Ruijie Zhang 為共同第一作者。

Frances Arnold教授。圖片來源：California Institute of Technology

用酶來催化有機反應并不新鮮，F(xiàn)rances Arnold教授堪稱這一領域內(nèi)的“女神”級人物。她課題組2016年一篇“酶法構(gòu)建C-Si鍵”的Science 工作，讓不少人驚呼構(gòu)建“硅基生命”終于成為可能（Science, 2016, 354, 1048-1051，點擊閱讀詳細），這一發(fā)現(xiàn)也入選了美國化學會C&EN 評選出的“2016年頂級科研成果”（點擊閱讀詳細）。

Arnold教授團隊之前研究分子內(nèi)C-H鍵胺化反應的工作，所用的是細胞色素P450單加氧酶的突變體——Arnold教授稱其為細胞色素P411。很自然地，Arnold教授團隊設想這些細胞色素P411或許可以用于催化分子間C-H鍵胺化（下圖）：首先細胞色素P411的血紅素輔基被還原為形成二價鐵狀態(tài)1，此后1與TsN3反應形成鐵nitrenoid中間體2，2與烷基底物3反應形成C-H鍵胺化的產(chǎn)物4并重生催化劑1。根據(jù)以往的經(jīng)驗，反應中可能存在競爭過程，中間體2會發(fā)生降解形成磺酰胺副產(chǎn)物5。以往工作已經(jīng)證明，細胞色素P411能夠高效催化分子內(nèi)C-H鍵胺化反應，原因是在分子內(nèi)反應中，參與反應的C-H鍵與形成的nitrenoid中間體2距離較近，一定程度上有利于反應進行。然而，在分子間C-H鍵胺化反應中，底物與nitrenoid中間體2距離較遠。因此為了保證C-H鍵胺化反應順利進行，nitrenoid中間體2需具有非常高的反應活性，使得分子間C-H鍵胺化反應的速率高于中間體降解的速率。

細胞色素P411催化分子間不對稱C-H胺化的設想機理。圖片來源：Nature Chem.

不過，實際實驗結(jié)果卻不讓人滿意，幾乎所有已知的細胞色素P411——包括那些對分子內(nèi)C-H鍵胺化及分子內(nèi)氮雜環(huán)丙烷化反應具有很高催化活性的工程酶，對分子間C-H鍵胺化都沒有任何催化活性，只是生成了相應的磺酰胺副產(chǎn)物。不過事無絕對，她們發(fā)現(xiàn)原本設計用于酰亞胺化反應的一種P411突變體——P411BM3 P-4具有微弱的活性，收率11%，e.e. 值14%。隨后她們針對P-4進行了定向進化，經(jīng)過系統(tǒng)的篩選終于發(fā)現(xiàn)一種突變體P411CHA（cytochrome P411 C-H aminase）具有最好的催化活性和選擇性（下圖）。

工程酶的定向進化。圖片來源：Nature Chem.

后續(xù)的研究中，作者發(fā)現(xiàn)P411CHA催化分子間不對稱C-H鍵胺化反應的TON（turnover number）可高達1300，遠遠高于過渡金屬催化分子間不對稱C-H鍵胺化反應的催化效率（目前報道的最高TON為85）。她們隨后對P411CHA催化反應進行了進一步的優(yōu)化，得到最優(yōu)條件，反應在水中、室溫條件下進行，胺化產(chǎn)物4的收率高達86%，對映選擇性很好（e.e. > 99%），TON為670

接下來是底物適用性研究。下圖中已列出大部分可以反應的底物，可以看出，目前該體系具有較大的底物局限性，吸電基團取代的底物產(chǎn)率很低。然而該體系也具有一定的優(yōu)勢，例如產(chǎn)物對映選擇性高、TON高等。

反應對底物的電性非常敏感（富電子底物產(chǎn)率較高），表明該反應中C-H鍵插入為決速步，氘代實驗（下圖a，KH/KD = 1.6）進一步驗證了這一結(jié)論。富電子底物反應產(chǎn)率高有兩種可能的原因：（1）相應的酶催化劑具有高C-H鍵胺化催化活性；（2）相應的酶催化劑一定程度上抑制了nitrenoid中間體降解的副反應。

通過對P411CHA酶結(jié)構(gòu)的研究（上圖b），她們發(fā)現(xiàn)P411CHA具有高效催化活性的原因在于酶較好地調(diào)節(jié)了活性氮物種與烷烴底物的交互作用，P411CHA具有合適的血紅素遠端口袋體積，底物通過范德華力與A87、L263、E267和V328等相結(jié)合，使得C-H鍵與氮賓距離較近，從而使分子間C-H鍵胺化反應得以高效進行。

——總結(jié)——

Frances Arnold教授課題組發(fā)現(xiàn)一種包含鐵-血紅素輔基的工程酶——細胞色素P411CHA對分子間芐位不對稱C-H鍵胺化反應具有高度的催化活性。盡管底物適用范圍有限，但反應具有非常明顯的優(yōu)點，即產(chǎn)物的對映選擇性高、TON高。另外，這種工程酶還有望用于更多目前化學催化不能實現(xiàn)的C-H鍵官能團化反應。通過對現(xiàn)有酶催化劑進行改進，人們有望解決一些傳統(tǒng)合成化學的難題，甚至挑戰(zhàn)目前化學催化無法實現(xiàn)的化學轉(zhuǎn)化。